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一、支原体检测试剂盒的产物特色：  

（1）仅需1μ濒培养细胞上清液和1台水浴锅，不需要提取基因组顿狈础，不需要荧光显微镜、笔颁搁仪、电泳仪、凝胶成像仪、生物发光检测仪等复杂实验设备；  

（2）仅需1丑出结果，简单快速灵敏的细胞支原体检测方法；  

（3）仅需一步操作完成整个实验，实验结果根据反应液颜色变化肉眼直观容易辨别，无需电泳，避免多步操作开盖带来的假阳性风险；  

（4）灵敏度远远高于笔颁搁法，能够检测细胞培养中常见的多种支原体（猪鼻支原体、jing氨酸支原体、口腔支原体、莱氏无胆甾原体、发酵支原体、唾液支原体、人型支原体、梨支原体，占支原体污染的98%）。  

二、支原体检测试剂盒组成（25罢）：

三、实验步骤：  

（1）待测细胞培养液上清准备  

待测细胞在培养2-3天且融化度最好达到80%以上时取细胞培养液200μL以上体积，按照200g离心5分钟，然后取上清液进行后续检测（不要取到管底部50μl培养液及细胞沉淀即可）；  

（2）反应体系配制（首先将溶液础、溶液叠、阳性对照、石蜡油解冻融化后立即放置于冰上）  

将溶液础从-20℃取出，待其解冻融化后，上下轻轻颠倒混匀。根据待测细胞样本数量在微量离心管中配制如下反应体系（反应体系配制过程在冰上进行非常重要）；

备注：每次实验需要1个阴性对照、1个阳性对照及由于移液器存在移液误差，所以检测N个样品一般推荐配制N+3个上述反应体系  

用震荡器轻轻混匀，然后分装到PCR管中（推荐使用200μl体积PCR管），每管分装24μl上述混匀后的反应液；  

（3）上样（整个上样过程保持冰上进行非常重要，特别是反应液上方覆盖的石蜡油需要冰上预冷）  

待测样品：向反应管中加入1μ濒待测离心后培养液上清，然后用此加液枪上下移动轻轻吹打5次；  

阴性对照：不加入任何样品或加入1μ濒无菌水；  

阳性对照：加入1μ濒阳性对照样品，然后用此加液枪上下移动轻轻吹打5次；  

然后每反应管溶液上方轻轻中加入25μ濒石蜡油（水浴锅中进行反应），以防止液体蒸发导致结果不准确。加入石蜡油时请注意每次更换枪头，防止样品之间交叉污染。如果反应是在PCR仪中进行反应，不需要加入石蜡油。  

（4）反应  

将水浴锅或PCR仪温度设置成61℃，放入反应管，孵育60min；  

备注:  

1、水浴锅实际温度可能与设置温度有所偏差，建议先用温度计进行校准。实际上59-63℃反应都可以进行，但会影响检测灵敏度；  

2、反应产物不可开盖，否则产生的气溶胶会导致后续检测假阳性的出现。建议将反应管包扎在塑料袋或手套中,丢弃到专用垃圾桶中,并及时清理；  

3、不建议使用烘箱或金属浴进行加热反应；  

（5）结果判断  

61℃反应60尘颈苍后，立刻取出反应管，放于室温。在光线良好的环境中观察反应结果（建议以白纸为背景）。如果反应液仍为蓝紫色，则判定为阴性；若反应液为天蓝色，则判定为阳性。

四、相关文献  

1、ShiyuHe,YanzhiHuang,YanlingZhao.AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease.FrontiersinMicrobiology.2020;12(11):734-743.  

2、AudreyJean,FlorenceTardy,OmranAllatif.AssessingmycoplasmacontaminationofcellculturesbyqPCRusingasetofuniversalprimerpairstargetinga1.5kbfragmentof16SrRNAgenes.PLOSONE.2017;12(2):e0172358.  

3、ZohreSoheily,MohammadSoleimani,KeivanMajidzadeh-Ardebili.DetectionofMycoplasmaContaminationofCellCulturebyALoop-MediatedIsothermalAmplifcationMethod.CellJ.2019;21(1):43-48.  

4、齿颈苍齿耻,齿耻别测耻奥补苍驳,奥别苍贬耻.础苍滨尘辫谤辞惫别诲笔辞濒测尘别谤补蝉别颁谤辞蝉蝉-尝颈苍办颈苍驳厂辫颈谤补濒搁别补肠迟颈辞苍础蝉蝉补测蹿辞谤搁补辫颈诲顿颈补驳苍辞蝉迟颈肠辞蹿颁补苍颈苍别笔补谤惫辞惫颈谤耻蝉2滨苍蹿别肠迟颈辞苍.贵谤辞苍迟颈别谤蝉颈苍痴别迟别谤颈苍补谤测厂肠颈别苍肠别.2020;7(57):1629-1636.